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2012年2月28日 ;78 (9) 文章

NMO的血清学诊断

水通道蛋白-4- igg检测的多中心比较

P.J.水域，a .麦肯，M.I.雷特，美国Rajasekharan，退役军人列侬，答:维拉波斯，j .宫，J.N. Mandrekar，答:文森特，答:酒吧或，中华民国Pittock
第一次出版2012年2月1日， DOI: https://doi.org/10.1212/WNL.0b013e318248dec1
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摘要

目的:视神经脊髓炎(NMO)免疫球蛋白G (IgG)(水通道蛋白-4 [AQP4] IgG)对NMO及相关疾病具有高度特异性，自身抗体检测已成为脱髓鞘疾病患者的必要检查。然而，尽管现在使用了不同的技术，但还没有进行多中心比较。本研究比较了不同检测方法的敏感性和特异性，包括一种内部流式细胞检测和两种商业检测(ELISA和基于转染细胞的检测[CBA])。

方法:在2个国际中心进行了6种检测方法(内部或商业)，使用来自NMO患者(35例)、NMO谱系障碍(25例)、复发-缓解型多发性硬化症(39例)、其他自身免疫性疾病(25例)和健康受试者(22例)的编码血清。

结果:通过定量流式细胞术检测IgG与表达重组AQP4的细胞结合，获得了最高的敏感性(77;60人中有46人)或视觉观察(CBA, 73%;44 / 60)。荧光免疫沉淀法和基于组织的免疫荧光法灵敏度最低(48% ~ 53%)。CBA和ELISA商业检测(100%特异性)的灵敏度分别为68%(41 / 60)和60%(36 / 60)，联合使用时灵敏度为72%(43 / 60)。

结论:在临床环境中检测NMO- igg的第二代重组抗原检测具有更高的敏感性和卓越的特异性，应能够早期诊断NMO谱系障碍，并迅速启动适合疾病的治疗。

术语表

AQP4=
aquaporin-4;
CBA=
细胞试验;
E=
EUROIMMUN;
流式细胞仪=
荧光激活细胞分选;
FIPA=
荧光免疫沉淀法;
免疫球蛋白=
免疫球蛋白G;
国际金融协会=
间接免疫荧光法;
米=
梅奥;
女士=
多发性硬化症;
动=
视neuromyelitis;
NMOSD=
视神经脊髓炎谱系障碍;
O=
牛津大学;
R=
RSR / Kronus;
中华民国=
受试者工作特征曲线

视神经脊髓炎(NMO)是一种严重的复发性炎症性中枢神经系统脱髓鞘疾病，主要影响视神经和脊髓。1目前，最常见的鉴别诊断是多发性硬化症(MS)。然而，与MS不同的是，NMO的残疾随着每次发作而增加。因此，早期诊断和治疗至关重要。2特异性免疫球蛋白G (IgG)抗体与中枢神经星形细胞膜结合的发现确定了目标为水通道水通道蛋白-4 (AQP4)，这有助于疾病的早期识别，并扩大了临床谱系，包括仅患有视神经炎或横断脊髓炎(视神经脊髓炎谱系障碍[NMOSDs])的患者。3.，4体外和体内的研究已经证明了这些自身抗体的致病潜力。5，- - - - - -，10然而，在患者血清中检测AQP4-IgG的不同方法对NMO和其他NMOSDs的敏感性不同。3.，4，11，- - - - - -，17在这项国际多中心研究中，对编码样本进行了6种不同的AQP4-IgG测定。

方法

标准方案批准，注册和病人同意。

这项研究得到了所有3个机构审查委员会的批准。

病人。

146名患者和对照受试者的血清样本进行了重复检测，其中35名患者符合Wingerchuck NMO诊断标准(1999年或2006年[不包括抗体状态])。2在患者中，有25人被研究人员归类为NMOSDs;本组包括14例纵向广泛横切性脊髓炎(9例复发)和8例视神经炎(5例复发;所有单次发作视神经炎的患者血清均呈阳性)。对照组共86例(健康对照组22例，杂病对照组64例[符合麦克唐纳复发缓解型MS标准，39例;Sjögren综合征，1例;系统性红斑狼疮4例;类风湿性关节炎1例;硬脊膜动静脉瘘，4;非炎症性脊髓病，3例;短节段-纵横性脊髓炎2例; sarcoid longitudinally extensive transverse myelitis, 1; polyclonal hypergammaglobulinemia, 1; and other, 8]) were also tested. The samples were provided by 3 institutions: Mayo Clinic, Rochester MN (93 patients), Neuroimmunology Group, Nuffield Department of Clinical Neurosciences, Oxford, UK (39 patients); and McGill University, Montreal, Canada (14 patients). For longitudinal analysis of antibody titers, 9 serum samples taken over 5 years from a single patient with NMO were analyzed.

所有样本都提交到麦吉尔大学，aliquote，重新编码，并冷冻返回到其他2个中心。在梅奥诊所进行的检测包括基于组织的间接免疫荧光(IIF)检测NMO-IgG，3.ELISA-R (RSR/Kronus, Ltd.提供;生产商推荐的血清阳性水平，5 U/mL或更大)，GFP-AQP4荧光免疫沉淀试验(FIPA-M)。13，18牛津大学的测试包括荧光免疫沉淀试验(FIPA-O)，11视觉荧光观察细胞法(CBA-O)，11，18和一种新的定量流式细胞术(荧光激活细胞分选[FACS])试验。结果被发送给麦吉尔大学的合著者(a.b.o)进行解码。随后，两家实验室根据制造商的说明(EUROIMMUN)进行了基于视觉荧光观察细胞的检测(CBA-E)，该检测纳入了单独转染人AQP4-M1或M23亚型的固定HEK293细胞。15已公布方法的详细资料见半岛投注体育官网®网址:www.半岛投注体育官网neurology.org．

流式细胞术。

用人AQP4和荧光蛋白dsRed的质粒转染HEK293细胞36小时后，将细胞胰蛋白酶化，重悬于Dulbecco改良的Eagle培养基、1%胎牛血清和1mm EDTA (FACS缓冲液)，浓度为1.0 × 106细胞/mL，在4°C旋转2小时。患者血清(在FACS缓冲液中稀释1:10)与1.0 × 10混合5(100 μL)。4°C保存15分钟后，清洗细胞，用Alexa 488标记的抗人IgG(在FACS缓冲液中稀释1:500)检测结合的IgG。细胞在400 μL磷酸盐缓冲盐水/5 mM EDTA中重悬30min后，用FACSCalibur分析。通过测量活细胞中的dsRed强度(PE-Texas Red通道)来确定转染水平(图e-1, y轴)。创建了两个门:较高的门捕获了表达高水平dsRed的细胞(图e-1中标记为R5);下门捕获未转染或转染不良的细胞(图e-1中标记为R7)，并作为每个样品的阴性对照。在绿色通道中测量结合IgG (x轴右移)。每一种血清的得分是通过从较高门的绿色荧光中值减去较低门的绿色荧光中值来确定的。

统计分析。

我们使用受试者工作特征曲线(ROC)分析来确定ELISA-R检测的最佳截断值，以最大限度地提高疾病敏感性和特异性，并使用SAS 9.1版分析所有数据。使用配对比例的McNemar检验来比较FACS、CBA-Oxford和ELISA-R的敏感性，并使用Bonferroni校正进行多次比较。

结果

经AQP4转染的HEK293细胞的IgG结合实验证明是最敏感的(图1和2A): facs (77%;60人中有46人)，CBA-O (73%;60人中有44人)，CBA-E (68%;41 / 60)。ELISA-R的敏感度次之(60%:36 / 60)。FIPAs和基于组织的IIF检测最不敏感(48%-53%)(表1，图2A).两种商业检测相结合(ELISA-R和CBA-E)鉴定出72%(43 / 60)的NMO/NMOSD样品为阳性，没有假阳性(表2)。化验间一致性总体良好(图2一个);60个样本中有28个在所有检测中呈阳性，仅遇到2个假阳性结果(FIPA-M)。

图1
图1 6种方法测定视神经脊髓炎(NMO)/水通道蛋白-4 (AQP4)-免疫球蛋白G (IgG)滴度在患者和对照组血清中的分布

6次测定的散点图，截点为虚线。ELISA-R有两个截止点，推荐截止点(5 U/mL)和修改截止点(1.6 U/mL)。CBA =细胞法;疾病控制;荧光激活细胞分选;FIPA =荧光免疫沉淀法;FU =荧光单位;HC =健康对照组;间接免疫荧光;梅奥诊所; ΔMGFI = difference in median green fluorescence intensity; NMOSD = neuromyelitis optica spectrum disorder; O = Oxford.

图2
图2 视神经脊髓炎(NMO)和NMO谱系障碍(NMOSD)队列检测的一致性

阳性样本用橙色背景标记+。阴性样本用白色背景标记。纵向广泛横贯性脊髓炎(LETM, TM)样本以蓝色突出;粉红色为复发性视神经炎(rON, ON)。(B)荧光免疫沉淀试验(FIPAs)的结果，在两个中心对来自单个患者的9个样本进行随时间绘制，证明了这种简单的检测方法监测连续样本的一致性。AUC =曲线下面积;CBA =细胞法;E = euroimmun;荧光激活细胞分选;FU =荧光单位; IF = immunofluorescence; M = Mayo Clinic; O = Oxford; ROC = receiver operating characteristic curve.

查看该表:
表1

6种水通道蛋白-4- igg检测的敏感性和特异性一个

查看该表:
表2

事后分析结果:CBA-E和ELISA-R结果一个

对ELISA-R原始数据的事后ROC分析显示，将截断值从5.0 U/mL降低到1.6 U/mL，灵敏度可从60%提高到70%。另外60例NMO或NMOSD患者中有6例被评分为阳性(图2一个,表2)。6例FACS和CBA-O阳性，5例CBA-E阳性;然而，也有2例假阳性结果(1例健康对照组和1例复发缓解型MS患者)。后两种假阳性样本在两种基于细胞的检测中均为阴性。

作为一种诊断方法，fipa不是很敏感，但它们被发现适合于系列测定(图2B)从一个病人身上采集了5年的9个血清样本也进行了盲法测试。FIPAs在两个测试实验室之间显示出惊人的可重复性，抗体水平与治疗反应之间呈正相关。AQP4-IgG值在单次输注利妥昔单抗(Rituxan)后下降，并在接下来的20个月内缓慢上升。第二次输注rituximab (Rituxan)将AQP4-IgG降低到几乎检测不到的水平。

讨论

敏感和特异性的检测NMO-IgG (AQP4-IgG)已成为评估炎症性中枢神经系统脱髓鞘疾病患者的重要实验室调查，因为血清阳性具有诊断、预后和治疗意义。几种不同的技术已经被用于检测这些自身抗体，此前国际上还没有进行过多中心比较研究。在这项全盲研究中，我们评估了不同的测定方法，包括一种新颖的内部FACS方法和两种最近可在市售的试剂盒测定(ELISA-R和CBA-E)。

内部的FACS和CBA-O检测被证明是最敏感的。这些检测方法与ELISA-R法的敏感性有显著差异。然而，将ELISA-R的推荐临界值从5.0 U/mL降低到1.6 U/mL消除了这些显著差异(表3)，但略微降低了ELISA-R的特异性。基于组织的IIF检测和FIPA检测由于敏感性较低(48%-53%)而不是最优的诊断检测。

查看该表:
表3

ELISA灵敏度的提高一个

在全球范围内，对AQP4-IgG检测的需求正在增加。在过去的12个月里，梅奥诊所的神经免疫学实验室在服务基础上检测了20334名患者的血清AQP4-IgG，牛津实验室检测了3500名患者的血清。进行流式细胞术检测所需的专业知识和资源阻碍了其在小型临床诊断实验室的使用。本研究证实，市售试剂盒(ELISA-R和CBA-E)对AQP4-IgG检测既敏感又特异。它们执行起来相对简单，试剂需求最小，并且易于使用目前可用的自动化平台，这使得非专业实验室能够提供敏感和特定的AQP4-IgG检测。本研究表明CBA-E可作为一种简便的常规检测方法。ELISA-R的下限为1.6 U/mL，可能是一种敏感的筛查工具，但在1.6 - 4.9 U/mL之间的血清需要CBA-E进行特异性验证。

检测方法的改进降低了NMO-IgG血清阴性的频率。确定不同CNS抗原特异性的IgG是否可以解释缺乏AQP4-IgG检测的NMOSD患者是很重要的。一个必要的前提是最大限度地提高AQP4-IgG检测的敏感性，以排除假阴性。在本研究背景下，FACS检测似乎是最有用的，而FIPA可能更方便用于纵向监测患者。功能检测有望获得与疾病严重程度相关的数据，并可能预测复发。19

作者的贡献

研究设计与概念化:p.j.w.， a.b.o。，年代。P．Drafting of manuscript: P.J.W., S.J.P. Acquisition, analysis and interpretation of data: P.J.W., A.M., M.I.L., S.R., V.A.L, A.V., J.P., J.N.M., A.Villalobos, A.B.-O., S.J.P. Statistical analysis: P.J.W., J.N.M., S.J.P. Critical revision of the manuscript: P.J.W., A.M., M.I.L., S.R., V.A.L., A.Villalobos, J.P., J.N.M., A.Vincent, A.B.-O., S.J.P.

信息披露

Waters博士是一项与Lgi1、Caspr2和Contactin2抗体检测相关的专利的具名发明人，并可能获得该技术的版税。Waters博士获得牛津NIHR生物医学研究中心的研究支持。McKeon博士得到了Guthy Jackson慈善基金会的研究支持。Leite博士获得了牛津生物医学研究中心、国家委托小组和英国Halley Stewart爵士信托基金的研究支持。Rajasekharan博士报告没有披露。Lennon博士是一项用于诊断视神经脊髓炎的水通道蛋白-4抗体专利的命名发明人，并获得该技术的版税;是与功能性AQP4/NMO-IgG检测和NMO-IgG作为癌症标记物相关的专利的具名发明人;并获得了Guthy Jackson慈善基金会的研究支持。维拉洛沃斯没有披露任何信息。他担任Merck Serono, Bayer Schering Pharma, Biogen Idec, Teva Pharmaceutical Industries Ltd.， Novartis和sanofi-aventis的科学顾问委员会成员; has received funding for travel from Merck Serono; and receives research support from the Multiple Sclerosis Society and the Department of Health Risk Sharing Scheme (Clinical Coordinator). Dr. Mandrekar reports no disclosures. Dr. Vincent is a named inventor on a patent relating to assays for the detection of antibodies to Lgi1, Caspr2, and Contactin2 and may receive royalties for this technology. Dr. Vincent has served on scientific advisory boards for the Patrick Berthoud Trust and the Myasthenia Gravis Foundation of America; has received funding for travel and a speaker honorarium from Baxter International Inc.; serves as an Associate Editor for大脑;的出版收取版税临床神经免疫学(布莱克威尔出版，2005)和儿童神经系统的炎症和自身免疫性疾病(Mac Keith Press, 2010);获得欧盟、牛津NIHR生物医学研究中心和Halley Stewart爵士信托基金的研究支持;并从Athena Diagnostics, Inc.获得了Musk抗体版税和咨询费，从英国加的夫RSR Ltd.获得了Musk抗体版税。A.V.总部所在的牛津大学(University of Oxford)接受神经系统疾病抗体分析的版税和报酬。Bar-Or博士担任BioMS Medical, DioGenix, Inc.， Ono Pharmaceutical Co. Ltd.， GlaxoSmithKline, Roche, Guthy Jackson Greater Good Foundation, NMO Research and Clinical Care Consortium的科学顾问委员会成员;担任编辑委员会半岛投注体育官网®和临床与实验神经免疫学“，;已获得来自Biogen Idec、Bayhill Therapeutics、拜耳先灵制药(Berlex)、礼来公司、基因泰克公司、葛兰素史克、默克雪兰诺、诺华、惠氏、赛诺菲安万特和梯瓦制药工业有限公司的演讲荣誉;并已获得BioMS Medical, Merck Serono, Bayhill Therapeutics, Biogen Idec, Genentech, Inc.和Teva Pharmaceutical Industries Ltd.的研究支持。Pittock博士是与功能性AQP4/NMO-IgG测定和NMO-IgG作为癌症标记物相关的专利的命名发明家;得到了Alexion制药公司、Guthy Jackson慈善基金会和NIH的研究支持。

鸣谢

作者感谢John Schmeling在Mayo Clinic进行检测并协助数据分析，Kevin Clark在流式细胞仪(WIMM, Oxford)方面提供建议，Klaus-Peter Wandinger博士和Christian Probst博士(EUROIMMUN)提供了EUROIMMUN CBA载片，RSR/Kronus提供了AQP4 ELISA-R试剂盒。

脚注

  • 研究经费:部分由Guthy-Jackson慈善基金会和NIH资助(NS065829-01)。p.j.w.， M.I.L, j.p.和a.m vincent得到了NIHR和NIHR牛津生物医学研究中心的支持。

  • 补充资料载于www.半岛投注体育官网neurology.org

  • 收到了2011年5月19日。
  • 接受2011年8月12日。

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