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背景神经纤维细丝(Nf)是主要的结构蛋白只在发生的神经元。在脊髓损伤(SCI)、疾病的严重程度量化的临床措施有限的灵敏度和可靠性,而且没有blood-based生物标志物建立了进一步分层损伤的程度。我们旨在检查是NfL免疫测定SCI的临床结果的预测。
方法纵向测量脊髓中央综合征患者进行血清NfL (CCS, n = 4) motor-incomplete SCI (iSCI, n = 10), motor-complete SCI(去找找cSCI, n = 13)和健康对照组(HC, n = 67),并与临床严重程度相关,神经的结果,和二甲胺四环素药物的神经保护作用。
结果基线NfL水平高iSCI(21个pg / mL)和去找找cSCI (70 pg / mL)比在HC (5 pg / mL, p = 0.006, p < 0.001)和CCS (6 pg / mL, p = 0.025, p = 0.010)。水平随时间增加(p < 0.001),高去找找cSCI与iSCI (p = 0.011)和比CCS (p < 0.001)。NfL水平与美国脊髓损伤学会(亚洲)电动机得分在基线(r =−0.53, p = 0.004)和24 h后(r =−0.69, p < 0.001)和3-12-month汽车结果(基线NfL: r =−0.43, p = 0.026和24小时NfL: r =−0.72, p < 0.001)。二甲胺四环素治疗显示了NfL水平去找找cSCI子群的病人。
结论SCI患者的血清浓度NfL显示与急性严重性和神经系统密切相关的结果。我们的数据提供了证据表明血清NfL的首次SCI患者的预后价值。此外,血NfL水平可能成为药物反应在SCI标记。
- 神经外科
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介绍
急性脊髓损伤(SCI)是一个最具破坏性的事故影响一个年轻和活跃的人口。机械损伤脊髓神经元损伤的轴突,神经胶质的面积的影响。1在几天,几周,几个二次损伤级联导致进一步进步内组织损伤和毗邻主要的病变,外生创伤后遗症的。除了创伤本身,二次伤害2,3代表一个窗口的治疗干预措施保护轴突和他们的支持结构。4 - 6最近的一项安慰剂对照试验建议临床改善跨几个措施在接受药物的病人中二甲胺四环素,结果7使用美国脊髓损伤学会(亚洲)考试。8亚洲考试可以用于确定亚洲年级受伤的严重性。尽管这是一个公认的分类,每个年级代表广泛类别的患者,和纵向变化缺乏敏感性规模不敏感标记作为药物反应。9一些生物标记已经评估了他们的能力更加敏感和准确的工具测量神经损伤,但在某种程度上,因为这些测试是局限于脑脊液(CSF),他们还提供了有限的临床实用性。10,11
神经纤维细丝(Nf)特异性神经元,主要结构蛋白释放到血液后神经元损伤,和可以量化使用高灵敏度的电化学发光(ECL)技术。12几个活动,二甲胺四环素会使小胶质激活,神经炎症和细胞凋亡,影响可能会减少神经元损伤反映在Nf在SCI的血清水平较低。4
我们分析了水平的Nf轻链(NfL)纵向血清样本来自学科进入二期临床试验研究二甲胺四环素的有用性脊髓损伤后减弱神经赤字。7我们报告的相关血清NfL急性和长期的临床结果。进一步,我们研究血清NfL的潜在药物反应的标志二甲胺四环素在SCI的治疗效果。
方法
卡尔加里大学的研究协议通过联合卫生研究伦理委员会。所有患者和健康对照组提供书面知情同意。从67年健康对照组血清样本(HC)和27 SCI患者(有足够数量的血清样本713)包括:患者motor-complete SCI(去找找cSCI;亚洲A或B;由于缺乏材料没有96小时(h)和108 h两个患者的样本和84 h和120 h样本为每一位病人),10 motor-incomplete SCI患者(iSCI;亚洲C或D;一个病人没有36 h样本)和4中央线综合症患者(CCS;亚洲C或D更有选择性损伤集中位于电动机大片和不成比例的大运动障碍上相比,下肢(意思是下肢运动成绩>上肢)13)(表1)。7手术减压和稳定进行了损伤后24小时内,受试者并不是用糖皮质激素治疗。病人被随机(1:1)接受静脉注射二甲胺四环素(惠氏制药200毫克的二甲胺四环素每天两次(低剂量),或800毫克锥形的负荷剂量100毫克每12 h,直到400毫克(高剂量),或安慰剂。更详细的程序和前面描述的纳入和排除标准。7
临床评估和分析的过程
亚洲神经功能评估使用标准化的神经系统检查,包括电动机(较高的分数从0到100,分数代表更好的运动机能)和感官(针刺和轻触范围从0到112,高分数代表更好的感官功能)复合材料。8这些检查1天(入学时间),4、5和7;周3、6和12;6个月和12。运动机能研究中观察到人口趋于稳定后3个月。7运动和感觉的结果被定义为运动或感觉得分的均值在时间点3、6和12个月。7
我们检查了血液样本SCI治疗前12 h内随机7天,之后每12 h(15时间点,包括基线示例)。样本将在10分钟2000克、整除在聚丙烯管和存储−2 h内80°C。7
一个橄榄球联盟(NfL的免疫测定内部开发Umea47:3)是用于量化NfL的血清。免疫测定是详细描述。12简单地说,96 -孔板(Multi-Array板,内消旋规模发现,马里兰州,美国)被涂上一层捕获单克隆抗体47:3 (UmanDiagnostics、期刊、瑞典)。坚持先前提出的术语,NfL的可溶性分数测量指定的捕获抗体上标(NfLUmea47:3)。14样本稀释1:1 Tris-buffered盐水含有1% BSA和0.1%渐变20。25µL标准,控制或博文血清白蛋白示例添加在副本和板在室温下孵化2 h。洗后,25µL二级抗体(0.5µg /毫升,马伯2:1)稀释在TBS含有1% BSA, 0.1%渐变20被添加到每个好,板在室温下培养1 h (UmanDiagnostics)。洗后,MSD SULFO-TAG标记链霉亲和素(0.25µg /毫升,默沙东,马里兰州,美国)稀释在TBS含有1% BSA,和0.1%渐变20了,在室温下培养1 h。最后洗后,150µL发射极耦合逻辑读缓冲区(MSD)稀释1:2添加蒸馏水和ECL信号,光电探测器探测到,测量使用MSD部门成像仪2400板的读者。四个参数加权逻辑适合生成曲线,样品浓度推断和分析使用发现工作台V.3.0软件(MSD)。如果需要,适当样本稀释的标准曲线。牛NfL是来自UmanDiagnostics和标准范围从10 0 pg / mL 000 pg / mL。平均intra-assay和interassay变异系数分别为4.3%和9.7%,分别。进行的调查人员测量没有获得的临床资料。
统计数据
组间基线特征比较利用克鲁斯卡尔沃利斯测试连续变量,或确切概率法分类变量。连续变量值和差,描述和分类变量的数量和百分比。NfL曲线下的面积(AUC) 7天采样周期使用梯形积分法计算。NfL值对数转换实现高斯分布。每天两次的纵向数据组(NfL)水平进行了分析使用mixed-effects线性回归,它允许重复测量和缺失值。单向方差分析与Bonferroni调整如果达成意义是用来比较日志组在各个时间点之间的橄榄球。此外,mixed-effects线性回归是用来测试对日志NfL,二甲胺四环素的影响运动成绩、针刺或轻触(基线值减去从所有值在各个时间点的分析)。因为病人每组的数量小,汇集分析(安慰剂对二甲胺四环素剂量方案)。电动机结果分为“好”或“贫穷”考虑截止的中值。所有与斯皮尔曼的相关性分析r。一个双边p值< 0.05被认为是重要的。 All statistical analyses were performed using Stata V.12 (StataCorp, College Station, Texas, USA) and Graph Pad Prism V.5.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA).
结果
疾病的特征
表1显示了SCI的基线特征子组和健康对照组。绝大多数(24/27)的患者宫颈的损伤。在所有子组,机动车事故代表三分之二的受伤的原因。去找找cSCI, iSCI和CCS患者整体损伤严重程度显著不同(亚洲得分,p < 0.0001),针刺(p = 0.020)和宽松的得分(p = 0.028),而运动成绩的差异在基线边缘显著(p = 0.053)。否则,没有明显差异对性别、年龄、或推迟手术。
14例患者(52%)接受低剂量(n = 5)或高剂量(n = 9)二甲胺四环素,和13个患者接受安慰剂。
NfL的水平基线和随访中
不同组间基线NfL水平(F (90) = 9.49, p < 0.001);iSCI (21 (15 - 90) pg / mL, p = 0.006)和去找找cSCI (70 (17 - 134) pg / mL, p < 0.001)有更高水平的血清比HC NfL (5 (2 - 11) pg / mL)。同样,血清iSCI和去找找cSCI NfL水平高于CCS (6 (0.3 -18) pg / mL, p = 0.025, p = 0.010) (图1)。
基线健康对照组血清NfL水平和脊髓损伤患者。在基线血清NfL水平不同组(F (90) = 9.49, p < 0.0001);电动机不完整的SCI (iSCI, p = 0.006)和运动完成SCI(去找找cSCI, p < 0.001)有较高的比健康对照组血清NfL (HC)。同样,血清iSCI和去找找cSCI NfL水平高于中央线综合症患者(CCS, p = 0.025, p = 0.010)。显示值和差。点代表个人样本。
有一个随着时间的推移提高血清NfL的水平(p < 0.001, mixed-effects模型)。从基线水平增加在所有三组高(p < 0.001),去找找cSCI与iSCI (p = 0.011)和CCS (p < 0.001) iSCI vs CCS (p = 0.045)。单个时间点差异,特别是在去找找cSCI和CCS,强(图2)。因此,NfL AUC显著高于去找找cSCI(4614(3486 - 7701))对CCS (1260 (420 - 2257), p = 0.012;F (24) = 5.9, p = 0.008)。
在不同组的血清NfL水平随着时间的推移,脊髓损伤患者。血清NfL水平随着时间的增加在整个组(p < 0.001, n = 27)从基线和所有三组(p < 0.001)。高血清NfL是motor-complete SCI(去找找cSCI, n = 13)与motor-incomplete SCI (iSCI, n = 10, p = 0.011)和中央线综合症患者(CCS, n = 4, p < 0.001)。ISCI水平更高的血清NfL相比CCS (p = 0.045)。单个时间点差异特别是在去找找cSCI和CCS强劲:满三角形:p < 0.01和CCS;semifilled三角形:p < 0.05对CCS技术;semifilled圈:p < 0.05和空圈:p > 0.05对CCS。中位数显示;提单:基线;数字低于轴:随访时间的小时。
基线NfL和运动、针刺和宽松的分数
NfL水平与运动成绩在基线(r =−0.53, p = 0.004;图3一个和表2),但不是用针刺或宽松的分数(表2)。水平还与一些postbaseline电机的分数,那么感官尺度(表2)。
NfL的相关性和NfL曲线下的面积(AUC)和运动成绩在基线(提单)(A);和运动的结果(B)。a .协会与基线汽车得分。左:提单NfL水平与运动成绩在提单(r = -0.53, p = 0.004;中央线综合症患者,CCS: r =−0.40, p = 0.6;motor-incomplete SCI, iSCI: r =−0.46, p = 0.184;motor-complete SCI,去找找cSCI: r =−0.63, p = 0.022)。中间:24小时NfL水平与运动成绩在提单(r =−0.69, p < 0.001;CCS: r = 0.5, p = 0.667;iSCI: r =−0.78, p = 0.008;去找找cSCI: r =−0.64, p = 0.017)。 Right: The NfL AUC correlated with the BL motor score (r=−0.74, p<0.0001, CCS: r=−0.8, p=0.2; iSCI: r=−0.73, p=0.017; cSCI: r=−0.65, p=0.017). B. Associations with motor outcome. Left: NfL levels at BL correlated with the motor outcome (r=−0.43, p=0.026, CCS: r=−0.40, p=0.600; iSCI: r=−0.44, p=0.206; cSCI: r=−0.29, p=0.334). Middle: 24H NfL levels correlated with the motor outcome (r=−0.75, p<0.0001; CCS: r=0.50, p=0.667; iSCI: r=−0.76, p=0.011; cSCI: r=−0.52, p=0.07). Right: The NfL AUC correlated with the motor outcome (r=−0.83, p<0.0001, CCS: r=−0.80, p=0.200; iSCI: r=−0.79, p=0.006; cSCI: r=−0.69, p=0.009). Filled triangles: cSCI; empty triangles: iSCI, open circles: CCS. The Spearman's correlation coefficients of the ranks and p-values are indicated.
有趣的是,血清NfL水平决定24 h后显示的基线运动评分(r =−0.69, p < 0.001),在其他所有取样时间点,也包括感官评分(图3一个和表2)。这些相关性是相似的频率和强度对NfL AUC(亚洲得分:r = 0.60, p = 0.001,图3一个和表2)。
NfL相关性的临床结果
电动机的结果趋于稳定在3个月后SCI(亚洲得分中位数:60分),无论受伤motor-complete, motor-incomplete或中央线的类型。正如所料,运动的结果是更好的在CCS(89点,p < 0.05)和iSCI(86.0分,p < 0.01)和去找找cSCI(25分),及相关与各自的基线值(r = 0.83, p < 0.0001)。7类似的基线和结果之间的相关性分数见过针刺和轻触(r = 0.63, p < 0.001, r = 0.58, p = 0.001)。
24 - 168 h期间受伤后,NfL水平越来越高(图4)患者的一个贫穷的结果(如下定义为平均运动得分,n = 13)相比具有更好的结果(中位数电动机得分高于中位数,n = 14, p = 0.001)。这是证实了NfL的AUC分析(更好的结果:1878(1058 - 3464)和糟糕的结果:5234 (3017 - 8584),p = 0.002)。符合基线与临床评分的相关性结果,NfL水平基线与汽车相关的结果(r =−0.43, p = 0.026,图3B),这种关系随着时间的推移变得更强的NfL测量后24 h (12 h: r =−0.56, p = 0.003;24小时:r =−0.72 (图3B);48 h: r =−0.82;72 h: r =−0.81;120 h: r =−0.79;144 h: r =−0.83;168 h: r =−0.82, p < 0.0001)和AUC分析(图3B)。类似的相关性被发现针刺和轻触的结果(数据没有显示)。
随着时间的推移NfL取决于运动的结果。患者更好的运动结果(所定义的值,n = 13)橄榄球水平要低于患者一个贫穷的结果(n = 14, p = 0.001)。单个时间点,一个可怜的患者之间的血清水平更高的血清NfL抽样结果24小时后和采样的168小时。中位数和相应的假定值(* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001)对贫困的结果和好的结果组显示。
NfL的相关性与二甲胺四环素治疗
治疗并不是均匀地分配在CCS, iSCI和去找找cSCI (表1);电动机得分在基线中值为30接受安慰剂的病人(n = 13, 54%去找找cSCI患者),46对那些接受低剂量(n = 5, 20%去找找cSCI患者)和26日接受高剂量二甲胺四环素(n = 9, 56%去找找cSCI患者)(p = 0.9050)。与安慰剂相比,治疗较低或高剂量的二甲胺四环素(基线运动得分中位数:27分)与安慰剂没有显著影响的纵向剖面上这组患者的血清NfL水平(p = 0.67, mixed-effects模型,图5A)。同样,二甲胺四环素治疗没有效果的纵向剖面运动(p = 0.495),针刺(p = 0.324)或宽松成绩在所有患者分析(p = 0.264)。更全面的分析二甲胺四环素治疗对神经系统的影响结果包括这些患者之前出版7。
比较之间的纵向血清NfL二甲胺四环素和安慰剂治疗的患者。答:在所有的病人(n = 27)用二甲胺四环素治疗(n = 14)和安慰剂(n = 13)没有影响血清NfL的纵向剖面水平(p = 0.671)。电动机完整SCI患者的b(去找找cSCI, n = 13)患者二甲胺四环素(n = 6, 5高剂量,1低剂量)纵向NfL水平要低于安慰剂(n = 7)治疗患者(p = 0.048)。c .患者基线运动得分低于基线的平均运动评分的患者(28分,n = 13) minocycline-treated病人(n = 7)显示趋势随着时间的推移NfL水平较低相比安慰剂组(n = 6, p = 0.085)。
相比之下,在去找找cSCI(6例接受二甲胺四环素和7病人接受安慰剂)minocycline-treated病人显示纵向NfL水平低于安慰剂(p = 0.048) (图5B)。二甲胺四环素去除后更加明显的影响的一个病人低剂量疗程(p = 0.006),或伤害的两个患者胸水平(p = 0.030)。
NfL水平的这种差异并不是平行的临床发现,治疗组之间的分数没有不同(电动机:p = 0.234;删除一个病人后低剂量二甲胺四环素:p = 0.132,或胸外伤患者的两个级别:p = 0.686;针孔:p = 0.681, p = 0.827, p = 0.417或轻触:p = 0.185, p = 0.186, p = 0.312)和未能表明二甲胺四环素治疗效果。
同样,在13个病人运动得分低于中位数运动评分(28)基线(iSCI 1患者CCS、3和9去找找cSCI), minocycline-treated病人(n = 7)显示趋势随着时间的推移NfL水平较低相比安慰剂组(n = 6, p = 0.085,图5C,删除后2例低剂量二甲胺四环素:p < 0.001)。再次,临床分数不是不同(电动机:p = 0.567, p = 0.972;针孔:p = 0.551, p = 0.656;轻触:p = 0.636, p = 0.320)二甲胺四环素和安慰剂治疗患者之间的关系。
讨论
这是第一个研究探索NfL的有用性在血清标记受伤的严重程度和结果在SCI患者,使用高灵敏度ECL-immunoassay。12橄榄球是最丰富也最可溶性Nf亚基,因素可能导致NfL的优越的敏感性神经丝重链(NfH)化验。15试验系统验证脑脊液和血清,后者允许收购纵向措施常规临床设置。
在急性和慢性神经损伤,轴突细胞膜释放中断Nf进入组织液,最终到达脑脊液和血液隔间。16,17在SCI,创伤会导致直接急性神经坏死,紧随其后的是二次伤害机制,增加神经元损失通过细胞凋亡或坏死,这一过程可能持续几天到几周。18,19
基线,iSCI和去找找cSCI NfL水平与健康对照组相比,增加了4.2倍和14倍和3.5倍,11.7倍和CCS相比,分别。7天随访,NfL在所有三个疾病组水平稳步上升,与最大水平(CCS: 230 pg / mL, iSCI: 384 pg / mL,去找找cSCI: 796 pg / mL)明显高于在更多的慢性疾病,如阿尔茨海默氏症(37 pg / mL)、格林-巴利综合征(102 pg / mL)或肌萎缩性脊髓侧索硬化症(120 pg / mL)。12只有有限的人力数据超过这个时间点:三四个亚洲和亚洲两个C患者达到最高NfH等离子体水平10天后在最近的试验研究,20.离开的峰值和持续时间的问题公开发布。
只有少量的研究调查了Nf在SCI CSF或血液。第一个NfL的有效性的证据在SCI标记神经元损伤的出现从一个研究调查急性脊髓病脑脊液:所有6 SCI患者和3 17的颈椎过度屈伸损伤显示增加NfL的浓度。21在SCI的鼠模型,NfH水平的血液22与损伤的程度有关,并减少与二甲胺四环素治疗:然而,这种差异没有达到意义。23同一组研究人员执行第一项研究在人类急性颈椎SCI: NfH在等离子体探测11的14包括病人、亚洲和亚洲水平显示高于C患者;然而,与临床相关部分的得分,结果不是。20.
亚洲的预后价值分级系统受限于缺乏个人理由随时间动态变化,及其对干扰的敏感性,由于其他的伤害,如头部或多系统创伤,和药物的影响。9这些限制对临床研究的结果是大量的病人数量达到足够的统计能力,观察不同的治疗方案。24将运动和感觉部分的得分可能会增加临床评分的准确性。20.我们的结果显示高NfL和运动成绩之间的相关性,在基线,在随访期间,和长期的结果,表明血清NfL可能是一个可靠的定量生物标志物SCI的程度。这可能是临床试验的背景下的特定值两分的可变性的临床评估可能会增加阈值来检测治疗效果。此外,血清NfL也可能允许评估损伤程度比亚洲级。特别是,它可能允许进一步分层和预测人口众多的亚洲一个受伤。
到目前为止,还没有药物可以改善SCI,尽管几个候选化合物在动物模型显示出可喜的成果。25日- 27日除了更大的人类疾病异质性相比,实验科学,28这次失败也可能认为,在某种程度上,缺乏敏感的生物标志物的动态测量范围广泛。
二甲胺四环素抗生素四环素,表明神经保护属性在各种模型的退行性和严重的神经系统疾病,包括科学,29-33通过路径无关其抗菌活性。4二甲胺四环素的审判,静脉加载和维持剂量达到血清水平与有效使用SCI的动物模型。7,34去找找cSCI的子组,尽管小样本大小、治疗的病人NfL显示低水平在每一个时间点超出24小时受伤后而临床量表对检测治疗组之间的差异。NfL水平的减少更明显排除患者胸SCI或低剂量二甲胺四环素。这些发现符合临床的研究核心7的胸SCI患者没有受益于二甲胺四环素治疗,低剂量和高剂量的比较二甲胺四环素组建议高剂量更大效果。
总之,我们的数据提供了新的证据,血清急性严重性的NfL可能代表一个有用的指标和长期的神经损伤的结果,特别是在精确的临床评估的情况下是不可能的。进一步的研究是必要的,增加的证据NfL在SCI药物反应标记。
引用
脚注
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相互竞争的利益j . Kuhle女士已经收到瑞士的研究支持社会,瑞士ALS协会Protagen AG)、罗氏、诺华和Genzyme并在科学顾问委员会Genzyme /赛诺菲-安万特,默克公司Serono和诺华制药公司。他的工作是由一个ECTRIMS研究奖学金计划和Forschungsfonds巴塞尔大学的,瑞士。j . Gaiottino报告没有披露。d . Leppert f .罗氏公司有限公司的一名雇员。摩根大通(J.P. Bestwick报告没有披露。a .作品已收到研究荷兰女士研究基金会的支持和被命名为发明人的专利使用神经纤维细丝作为神经元的生物标志物(WO2012005588A3)损失。答:Malaspina报告没有披露。r·多布森报告没有披露。C陆报告没有披露。G Disanto报告没有披露。n .气动元件是受雇于UmanDiagnostics AB,瑞典。 A. Nissim reports no disclosures. L. Kappos reports, the University Hospital Basel as employer of Dr. Kappos has received and dedicated to research support fees for board membership, consultancy or speaking, or grants, in the last 3 years from Actelion, Advancell, Allozyne, Bayer, Bayhill, Biogen Idec, BioMarin, CSL Behring, Eli Lilly, European Union, GeNeuro, Genmab, Gianni Rubatto Foundation, Glenmark, Merck Serono, MediciNova, Mitsubishi Pharma, Novartis, Novartis Research Foundation, Novonordisk, Peptimmune, Roche, Roche Research Foundation, Sanofi-Aventis, Santhera, Swiss MS Society, Swiss National Research Foundation, Teva, UCB, and Wyeth. RJ Hurlbert reports no disclosures. VW Yong reports no disclosures. G. Giovannoni has received research grant support from Bayer–Schering Healthcare, Biogen–Idec, GW Pharma, Merck Serono, Merz, Novartis, Teva and Sanofi–Aventis. He has received personal compensation for participating on Advisory Boards in relation to clinical trial design, trial steering committees and data and safety monitoring committees from: Bayer–Schering Healthcare, Biogen–Idec, Eisai, Elan, Fiveprime, Genzyme, Genentech, GSK, Ironwood, Merck–Serono, Novartis, Pfizer, Roche, Sanofi–Aventis, Synthon BV, Teva, UCB Pharma and Vertex Pharmaceuticals. S Casha reports no disclosures.
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