雌激素受体基因、认知能力下降与阿尔茨海默病|神经学半岛投注体育官网

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摘要

背景及目标女性患阿尔茨海默病(AD)痴呆症的终生风险是男性的两倍，绝经后低雌激素水平被认为是一个可能的因素。我们检查了3个呃（GPER1，ER2,ER1)与AD特征相关的变异，作为测试女性雌激素和AD之间关系的间接方法。虽然研究的重点是女性，但在比较中，我们分别进行了检查呃男性的分子变异。

方法在两项衰老的纵向临床病理研究中，对参与者进行了平均10年的随访。整体认知能力的评估采用了19项神经心理学测试得分的综合评分。死后病理评估包括检查3个AD(由免疫组织化学确定的淀粉样蛋白-β和tau蛋白缠结，以及由弥漫性和神经性斑块和神经纤维缠结计数得出的整体AD病理评分)和8个非AD病理指标。呃分子基因组变异包括基因分型和检测呃包括背外侧前额叶皮层(DLPFC)在内的大脑区域的DNA甲基化和RNA表达是认知的主要参与者，通常具有AD病理。

结果基线时女性(N = 1711)的平均年龄为78.0岁(SD = 7.7岁)。对于女性,GPER1分子变异与AD性状的关联最为一致。GPER1DNA甲基化与认知能力下降、tau蛋白缠结密度和整体AD病理评分相关。GPER1DLPFC中RNA的表达与认知能力下降和tau蛋白缠结密度有关。其他的联想包括ER2而且ER1序列变异和DNA甲基化与认知。参与激活er信号机制的基因DLPFC中的RNA表达也与女性的认知能力下降和tau纠结密度有关。在男性(N = 651，基线平均年龄:77.4岁[SD = 7.3])中，两者之间的相关性较弱呃分子基因组变异与AD认知和病理特征。两者之间没有发现一致的联系呃分子基因组变异和非ad病理在任何性别。

讨论呃DNA甲基化和RNA表达，在某种程度上呃在女性中，多态性与AD认知和病理特征相关，在男性中影响较小。

术语表

ACC＝: 前扣带皮层；
广告＝: 阿尔茨海默病；
一个β＝: -β淀粉样蛋白；
DLPFC＝: 背外侧前额叶皮层；
呃＝: 雌激素受体；
罗斯福＝: 错误发现率；
GPER1＝: G蛋白偶联雌激素受体；
IRB＝: 院校检讨委员会；
物＝: c-Jun n -末端激酶；
地图＝: 记忆与衰老项目；
MCI＝: 轻度认知障碍；
PCC＝: 后扣带皮层；
ROS＝: 宗教修会研究

美国老年痴呆症患者中，女性占60%以上，¹女性患老年痴呆症的风险是男性的2倍。²随着老年女性在绝经后失去雌激素的主要来源，雌激素水平降低^3.被认为是老年女性易患阿尔茨海默症的原因之一。⁴先前的研究表明，绝经年龄较大和生育年龄较长与老年女性较高的认知水平有关。^5，6较低的生物利用度雌二醇水平在老年妇女中与较高的认知障碍风险相关。⁷然而，研究绝经后激素治疗预防认知能力下降的随机临床试验结果没有发现任何益处。^8，9这些不一致的发现可能源于不同的原因，包括局部产生的雌激素会影响大脑功能¹⁰高于循环雌激素。因此，需要探索其他途径来阐明雌激素是否与老年妇女的认知能力有关。

雌激素有1个跨膜受体，即G蛋白偶联雌激素受体(GPER1)和2个类固醇受体，即雌激素受体α (ER1)和β (ER2)，它们是介导雌激素活性的主要受体。由于雌激素和认知之间可能存在联系，^5，7几个代表性的^11，12很少有纵向研究^13，-，15已经检查了ER1而且ER2伴有认知障碍或认知衰退的多态性。在这些研究中，只检查了少数选择的多态性。在这项研究中，首要的研究问题是检查之间的联系呃分子基因组变异与老年女性认知能力的关系，我们在4个领域扩展了之前的研究。首先，我们检查了常见的单核苷酸序列变异ER1而且ER2．其次，我们也检查了GPER1哪些序列变异与激素敏感性疾病有关^16，17但没有在认知方面进行研究。第三，我们检查了呃序列变异与阿尔茨海默病(AD)和相关痴呆病理指标。第四，我们检测了DNA甲基化和RNA表达呃与认知能力下降相关的基因，与病理指标相关。虽然研究的重点是女性，但在比较中，我们分别进行了检查呃男性的分子变异。

方法

参与者参加了两项关于社区老年人的纵向研究之一:宗教秩序研究(ROS)和拉什记忆与衰老项目(MAP)。作者之一大卫·A·贝内特(David A Bennett)是两项研究的主要研究员。ROS于1994年开始招生，招收美国各地的修女、牧师和弟兄。MAP于1997年开始登记，登记居住在伊利诺伊州东北部个人住宿或退休中心的老年人。符合条件的参与者是在登记时没有已知痴呆症的老年人，他们同意进行年度认知和临床评估，并在死亡时接受大脑捐赠。实施相同的方案，由相同的训练有素的人员进行认知和临床评估，促进了ROS和MAP的联合分析，其细节在其他地方有描述。¹⁸

我们纳入了1711名基线时无痴呆的女性，有可用的基因型数据，并至少进行了两次认知评估。在1711名女性中，917人死亡，并进行了死后病理检查。后期呃甲基化数据在420和呃738的表达水平。相应数量的男性有基因型数据为651人，甲基化数据为222人，RNA表达数据为323人。分析样品流程图如图1-2所示，links.lww.com/WNL/C615．维恩图说明了不同数据集的样本量(e图3-4)。

基因型处理

DNA是从外周血或冷冻脑组织中提取的。在Affymetrix genome wide Human SNP Array6.0或Illumina Omni Quad Express平台上进行基因分型。通过质量控制步骤后，¹⁹序列变异剂量被计算在单倍型参考联盟面板上。在本研究中，我们检查了位于3呃基因区及其10千碱基侧翼区。如果小等位基因频率<1%、imputation评分<0.3或缺失率>5%，则排除序列变异。因为这项研究的主要目标是在基因水平，而不是序列变异水平，我们没有根据它们的连锁不平衡修剪序列变异。共产生141个序列变异GPER1， 697英寸ER2， 1547人ER1本研究要检查的区域。

DNA甲基化过程

冷冻的背外侧前额叶皮层(DLPFC)样本用于获取DNA甲基化数据。选择DLPFC作为分子评估的大脑区域，是因为它在认知活动中至关重要，并且在老年人中经常有AD病理。

使用Qiagen QIAamp DNA mini协议从DLPFC灰质中提取DNA。DNA甲基化使用珠状法产生(Infinium HumanMethylation450;Illumina公司)。进一步处理原始甲基化数据以进行质量控制，^20.这导致420,132个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)位点的DNA甲基化值不同。在本研究中，我们检查了位于3呃基因区及其10千碱基侧翼区。共产生84个CpG点GPER150英寸ER2， 76个ER1本研究要检查的区域。

RNA表达加工

DLPFC是进行RNA提取和处理的第一个大脑区域。²¹使用Qiagen公司的miRNeasey迷你试剂盒和RNase free Dnase Set从冷冻的DLPFC样品中提取rna。通过质量控制标准的RNA样本在Illumina HiSeq平台上测序，使用链特异性脱氧尿苷三磷酸法和poly(A)选择制备RNA-seq文库。RNA-seq数据被进一步处理，只保留高表达基因，结果得到13484个基因。

最近，我们使用Zephyr G3下一代测序工作站(Perkin Elmer)根据制造商的说明进行了微小的修改，从DLPFC、后扣带皮层(PCC)和前扣带皮层(ACC)中生成了TruSeq链总RNA库(Illumina, 20020599)。²²文库在Illumina NovaSeq 6000平台上测序，测序长度为40-50 M，配对端为2 × 150 bp。尽管表达水平GPER1而且ER2可用时，ER1表达水平不符合质量控制标准。

认知评价

每年进行21项神经心理测试(方法、links.lww.com/WNL/C615)由在两个队列中工作的研究助理进行管理，并由一位培训师进行培训。其中两项测试仅用于诊断目的，其余19项测试(在ROS和MAP参与者之间以及在整个就诊之间进行相同的测试)的得分使用所有参与者基线得分的均值和SDs进行标准化。整体认知得分是19个标准化神经心理学得分的平均值。我们在之前的研究中使用了这些认知的综合测量方法^23，24因为从多个指标得出的复合变量更适合用于纵向分析²⁵我们需要随机误差更少的变量包括下限和上限效应。

在每年的访问中，一名神经学家和一名神经心理学家回顾了认知和临床数据，并根据既定的标准判定是否存在轻度认知障碍(MCI)或痴呆症。²⁶

死后病理评估

死亡至尸检时间间隔的中位数(Q1-Q3，范围)为6.8(5.1-10.2,1-76.3)小时。详细的程序描述在别处。^18，27一个半球冷冻用于多组学和生化分析，另一个半球固定在4%甲醛溶液中。固定的半球被切成1厘米厚的平板，并从预定的大脑区域制备组织切片，由不了解临床数据的专家检查AD和非AD病理。

通过免疫组织化学检查8个大脑区域的切片，以评估淀粉样蛋白β (Aβ)和tau标记的缠结，使用抗Aβ和磷酸化tau的抗体。²⁸通过图像分析，Aβ抗体标记的隔室在每个大脑区域中被量化为标记隔室所占面积的百分比，并在大脑区域中平均以产生总体Aβ负荷。类似地，通过平均区域tau标记的缠结来计算大脑的总体tau缠结密度，这些缠结使用立体成像技术进行计数。

用改良的Bielschowsky银染色法观察5个大脑皮层区域的神经斑块、弥漫性斑块和神经原纤维缠结。通过对3项指标的汇总测量取平均值，得出AD的整体病理评分。此外，一名委员会认证的神经病理学家对临床数据一无所知，使用既定的标准确定了AD的病理诊断。²⁹

Non-AD病态

我们还检查了3种神经退行性病变(Lewy小体、交互反应DNA结合蛋白43 [TDP-43]和海马硬化)和5种脑血管疾病(大梗死、微梗死、动脉粥样硬化、小动脉硬化和脑淀粉样血管病变)病理的指标，这些病理在方法中有描述。links.lww.com/WNL/C615在之前的研究中。²⁷

协变量

性别、种族和受教育年限在基线时通过自我报告获得。基线年龄和死亡年龄由出生日期(基线时获得)、基线访谈和死亡计算。

统计分析

采用方差分析、χ分析比较不同分析数据集参与者的特征²，以及Kruskal-Wallis测试。使用线性混合效应模型来检查多年随访的认知能力下降。核心模型包括截距(认知水平)、时间(认知下降率)、年龄、教育以及年龄和教育与时间的相互作用。在检测序列变异的模型中，时间处理与检测DNA甲基化或RNA表达的模型不同。在序列变量模型中，对核心混合效应模型的时间项进行了前瞻性分析。研究基线时时间为零，此后多年随访均为阳性。相比之下，在死亡时测定DNA甲基化和RNA表达水平，死亡时为零，死亡前几年为阴性。

然后，在单独的混合效应模型中，我们分别通过添加序列变体的术语及其与时间的相互作用来检查每个序列变体的剂量与认知衰退水平和速率的关联。p每个序列变体的关联值呃使用Fisher乘积法分别结合基因区来判断认知衰退的水平和速率，^30.如前所述。³¹这种综合方法检验一个零假设，即所检查的序列中没有一个变量在一个点处呃基因与结局(认知能力下降水平或率)相关。综合测试可以处理任意的依赖结构，是强大的和计算效率的提高能力在测序研究。³²当综合测试表明基因多态性与结果的相关性时，我们随后检查了每个序列变体，以确定与结果相关的特定序列变体。在进一步的分析中，我们用每个CpG位点的DNA甲基化水平或的mRNA表达水平替换序列变体呃基因。

然后，我们检查了呃AD和非AD病理指标的多态性、甲基化和表达水平。在检查AD病理指标时，我们用线性回归代替混合效应模型，在检查非AD病理时，我们用逻辑回归代替混合效应模型。

对模型假设进行了图形和数值评估。我们应用Benjamini和Hochberg错误发现率(FDR)³³以减少由于多次测试导致的I型错误的膨胀。至于节俭，只有罗斯福修正过p报告了-值(q值)，q值小于0.05为拒绝原假设的指标。

标准方案批准、注册和患者同意

所有参与者都签署了知情同意书和《解剖赠与法案》。拉什大学医学中心机构审查委员会(IRB)批准了每项研究。IRB批准号为L91020181 (ROS)和L86121802 (MAP)。

数据可用性

这些数据可以通过拉什阿尔茨海默病研究资源共享中心获得radc.rush.edu．要获取数据，必须填写一份申请，包括研究前提和研究计划的简要描述。

结果

用于分析序列变异、DNA甲基化和RNA表达的3个女性数据集的人口统计学和其他特征总结在表1．在基线时，序列变异数据集中女性的平均年龄为78岁，比其他2个由已故参与者组成的数据集年轻3岁(表1，links.lww.com/WNL/C615)．虽然三个数据集的教育水平没有差异，但在与基线时最年轻一致的序列变异数据集中，基线时的认知水平最高(表1)。

查看该表:

表1

研究参与者的特征

序列变异数据集中的女性随访时间最长，平均为10年。在基线时，24%的人被诊断为轻度认知障碍，没有人患有痴呆症，而在死亡前平均1年进行的最后一次访问中，24%的人患有轻度认知障碍，43%的人患有痴呆症。有AD病理诊断的患者痴呆发生率高于无AD病理诊断的患者(55% vs 21%， χ²= 97.5, df = 1，p< 0.001)。

协会呃女性的多态性、DNA甲基化和RNA表达总结在表2，并在下面详细说明。

查看该表:

表2

3雌激素受体相关研究综述(呃老年妇女认知纵向变化的基因和潜在病理

GPER1女性

Polymorphisms-Cognition

使用混合效应模型和随后的综合测试表明GPER1多态性与基线时的整体认知水平相关(q = 0.028)，但与认知衰退率无关。检查个体序列变异表明，1(1%)序列变异与整体认知水平相关(图1；eTable 2,links.lww.com/WNL/C615)．

图1 雌激素受体基因多态性与DNA甲基化的关系ER1，ER2,GPER1与全球认知水平和认知衰退速度有关

在每个图中，所检查的遗传区域的所有序列变异(绿圈)和CpG位点(蓝圈)与整体认知水平(A)或认知下降率(B)的关系被说明。x轴为序列变异体/CpG位点的染色体位置，y轴为fdr校正后的位置p- SNP/CpG位点与结果之间的关联值。水平的红色虚线显示了在统计学意义上相关的水平。GPER1= G蛋白偶联雌激素受体;FDR =错误发现率。

Polymorphisms-Pathologies

综合测试表明GPER1多态性与AD病理指标无关。在检查与非ad病理的联系时，GPER1多态性仅与微梗死相关(q = 0.038)。分别检查个体序列变异，在FDR校正后，11个序列变异与微梗死相关(表3，links.lww.com/WNL/C615)．

DNA Methylation-Cognition

认知衰退率(q < 0.001)和死亡时认知水平(q < 0.001)均与死亡有关GPER1死后检测DNA甲基化。检查个体CpG位点表明，大多数重要的CpG位点与认知能力下降的速度和认知水平相关(图1；eTables 4 - 6,links.lww.com/WNL/C615)．

图2 雌激素受体基因甲基化与阿尔茨海默病病理指标的关系

在每个图中，从线性回归中推导出了被检查遗传区域中单个CpG位点与淀粉样蛋白-β负荷(A)、tau纠结密度(B)或全局AD病理评分(C)的关联。y轴表示fdr校正p-value表示关联，x轴表示CpG位点在基因组中的位置。x轴上的颜色带表示遗传区域的染色质状态。(A)淀粉样蛋白-β负荷，(B) tau蛋白缠结密度，(C) AD总体病理评分。FDR =错误发现率。

DNA Methylation-Pathologies

DNA甲基化GPER1与tau缠结密度(q = 0.013)和AD整体病理评分(q = 0.013)相关。检测单个CpG位点表明，10和14个CpG位点的DNA甲基化值GPER1分别与FDR矫正后的tau蛋白缠结密度和整体AD病理评分相关(图2，表7，links.lww.com/WNL/C615)．GPER1位点的DNA甲基化与任何非ad病理无关。

RNA Expression-Cognition

认知能力下降率(估计=−0.014，标准误差[SE] = 0.004, q = 0.005)和死亡时的最终认知水平(估计=−0.181,SE = 0.045, q < 0.001)均与GPER1死后DLPFC的表达水平(图3)．为了说明效应大小，我们使用了模型导出的估计(表8，links.lww.com/WNL/C615)比较2例具有代表性的DLPFC水平不同的女性认知能力下降率GPER1RNA表达。认知能力下降的女性(90^th百分位= 14.9)水平GPER1RNA表达比低(10^th百分位= 12.8)水平。

图3 协会GPER1死亡前认知能力下降的表达水平

在每个图中，关联的表达水平GPER1DLPFC(左图)或PCC(右图)显示死亡前10年认知能力下降。每幅图都说明了一个平均90岁、受教育16年的女性的认知轨迹，其中低(第10百分位)或高(第90百分位)的表达水平呃基因。背外侧前额叶皮层;GPER1 = G蛋白偶联雌激素受体;后扣带皮层。

只有认知水平(估计=−0.201,SE = 0.076, q = 0.026)，而不是下降的速度(估计=−0.015,SE = 0.007, q = 0.083)与表达水平相关GPER1在PCC (图3)．GPER1ACC的表达水平与认知能力下降无关。

RNA Expression-Pathologies

检查关联GPER1与AD病理指标相关的表达水平表明，DLPFC的表达水平与tau缠结密度相关(估计= 0.140,SE = 0.051, q = 0.039)，但与Aβ负荷或整体AD病理评分无关(图4)．为了说明效应大小，我们使用了模型导出的估计(表9，links.lww.com/WNL/C615)比较2例具有代表性的不同DLPFC水平女性的tau缠结密度GPER1RNA表达。Tau缠结密度在高(90百分位)水平的女性中高19%GPER1RNA表达较低(第10百分位)水平。

图4 协会GPER1AD病理指标在背外侧前额叶皮层(DLPFC)、后扣带皮层(PCC)和前扣带皮层(ACC)的表达水平

GPER1= G蛋白偶联雌激素受体。

在表达水平之间没有发现相关性GPER1PCC或ACC和AD的病理指标。在检查非ad病理时，GPER1表达与其中任何一种都无关。

DNA甲基化- rna表达

因为DNA的甲基化和RNA的表达GPER1在DLPFC中与认知能力下降和tau纠结密度相关，我们检查了它们本身的相关性。DNA甲基化和RNA表达GPER1与DLPFC无相关性。